专访华科朱斌教授：改写“游戏规则”，全新DNA聚合酶不需要引物

3月16日，《PNAS》期刊在线发表一篇论文，题为“Deep-sea vent phage DNA polymerase specifically initiates DNA synthesis in the absence of primers”，翻译过来即“在深海火山病毒中发现一种不需要引物的DNA聚合酶”。更让笔者惊喜的是，文章的通讯作者是中国科学家——华中科技大学生命科学与技术学院教授、“青年千人”朱斌博士。

生物狗一般都知道，DNA聚合酶是PCR、DNA测序等生物技术的核心工具，它负责DNA的合成，但是反应需要一段特定长度的DNA或RNA引物作为复制起始点。现在，这篇由中国团队与哈佛大学、日本地球海洋科技局合作完成的最新成果却颠覆了传统认知，首次揭示了存在于自然界、不依赖于引物的特殊聚合酶。

带着小兴奋和大好奇，笔者联系到朱斌教授并对其进行了专访，请他详细解析了这一全新DNA聚合酶的“真面目”，并分享了他专注于“核酸代谢酶开发”的研究心得。

1、改写“游戏规则”：全新DNA聚合酶不需要引物

DNA聚合酶催化DNA合成需要满足4个条件：单链DNA模板、四种脱氧核糖核苷三磷酸底物（dNTPs）、镁（锰）离子和一段杂交于DNA模版上的引物（DNA或RNA）。

朱斌解释说：“通常，体外PCR反应所需的引物是一段合成的DNA。而在体内，引物一般是指由另一类特殊聚合酶——引发酶（primase）合成的小段RNA。”

为什么传统DNA聚合酶需要引物？

朱斌表示，DNA聚合酶从头聚合几个最初的核苷酸并将其稳定在DNA模版上不解离，这需要其与模版的强结合，但是对于已经和模版DNA结合稳定的新生DNA链，它的快速延伸却不能有如此强的结合。这两者对于一个酶活性中心来说是矛盾的。

为了解决矛盾，自然设计了两类聚合酶（DNA聚合酶、引发酶）。其中，DNA聚合酶具有很强的延伸性、却不能从头合成，而引发酶可以从头合成但是延伸性较差、反应慢。

所以，两个酶分工合作：引发酶负责合成最初的几个到十几个核苷酸（引物），DNA聚合酶负责后续的延伸。而在体外，因为缺乏引发酶，所以我们需要自己动手合成引物，供DNA聚合酶“享用”。

为什么全新DNA聚合酶不需要引物？

朱斌团队在深海火山处找到的这一存在于噬菌体中的全新DNA聚合酶却不需要引物。这是为什么呢？它奇妙在哪里？

朱斌一一为我们解答，他说：“这个酶体现了噬菌体这一最简单生命体的高效和简洁，它巧妙地以一个较小的蛋白质将引发酶和DNA聚合酶功能集于一身。而且，它表现出自然界另一类聚合酶——DNA依赖的RNA聚合酶的特点。”

根据朱斌的讲解，这一新型聚合酶识别DNA模版上的一段特异性8核苷酸序列（显著长于引发酶的识别序列3－4个核苷酸，但比RNA聚合酶启动子要短），用脱氧核糖核苷三磷酸从头起始DNA合成（引发酶一般用核糖核苷三磷酸）。在完成最初的5核苷酸合成后，聚合酶会经历一个较大的构像变化，从起始模式转为经典DNA聚合酶的延伸模式，转换过程中会释放出较多2－5个核苷酸长度的中断产物。这一特点与RNA聚合酶释放启动子类似。因此它结合了自然界三大类聚合酶的特点。

2、DNA聚合酶的“发现之旅”：探索未知蛋白

这一聚合酶是在海洋微生物（噬菌体）中发现的。海洋里的噬菌体占海洋所有生命个体总数的90％以上，是地球上数量最大的生物类群，是地球生态的主宰力量。而且，噬菌体的主要生命活动是复制其基因组，因此它们的大部分蛋白质功能都和核酸代谢相关。

“越是简单的物种，从总体上讲多样性就越大，大肠杆菌噬菌体T7可能是被研究历史最长的物种之一，但它仅有的五十余个蛋白质至今仍有约一半功能未知。”朱斌表示，“目前，人类广泛开展研究的模式生物只有少数几种，科学界关注的微生物多是与疾病相关的几种常见细菌和病毒。从蛋白质角度来说，我们触及的只是冰山一角。”

研究中的困难和惊喜

探索未知，会遇到很多难题。采访中，朱斌表示研究未知蛋白最大的困难是获取大量的纯化蛋白质样品。因为大多数新颖微生物无法在实验室大量培养，只能将其基因克隆至大肠杆菌进行异源蛋白表达，然后摸索表达纯化条件。但是，对于从未被研究过的全新蛋白质而言，所有表达纯化条件都要从头摸索，这意味着无数次的失败。

“而且，我们只能根据基因的位置和大小推测这一未知蛋白是否与DNA复制相关。这无疑增加了风险。但是，当我们获得证明它确实是DNA聚合酶的第一份试验结果时，一切又都是值得和喜悦的。那种揭开未知事物奥秘的感觉，无法形容。”朱斌谈及研究过程时如此表述。

3、结构“异于寻常”：现在谈应用还为时尚早

谈及DNA聚合酶的结构特征，朱斌表示，已知的DNA聚合酶结构类似于于“一只手”，由手掌、手指（等同于经典结构域）组成。

传统DNA聚合酶的结构示意图

然而，他课题组最新发现的DNA聚合酶，从氨基酸组成序列以及尚未发表的初步结构生物学研究来看，都不具有任何已知DNA聚合酶的结构特征。朱斌强调：“它的活性口袋构像与古菌的引发酶略有相似，但它没有引发酶所具有的典型锌指结构，而且除活性口袋之外的结构在自然界中找不到任何相似蛋白质。”

我们好奇的是，这一不需要引物的DNA聚合酶是否会改变传统的PCR范式？能否被广泛应用于基因测序、核酸合成中？朱斌却很谨慎地表示：“目前谈论应用细节还为时尚早。鉴于DNA聚合酶在生物技术发展史上的地位，我们可以期待它在核酸合成和测序中找到特定的用途。”

他认为，现有任何一个工具酶从发现到真正投入应用都经历了大量详尽深入的基础研究，只有对其各方面性能详细准确地阐明之后才有可能被开发为工具。对于这一最新发现的聚合酶而言，目前他们只是定性地揭示了它的几个显著特点，对其反应最适条件、专一性、延伸性等重要指标还未定量研究。另外结构的研究也在开展中，这对于了解酶的机理，以及酶的改造优化非常重要。

4、专注“核酸代谢酶”：既是专长也是兴趣

2007年，朱斌毕业于中科院上海生化细胞所并取得生物化学与分子生物学博士学位，这期间师承王恩多院士。随后，他进入哈佛大学Charles C. Richardson教授实验室开展博士后研究。2016年回国在华中科技大学任职（博导、教授），并入选当年的“千人计划”青年人才。

Charles C. Richardson教授实验室是很多著名核酸工具酶的诞生地，例如T4 DNA连接酶、T4 多聚核苷酸激酶和测序酶等。其中，测序酶奠基了现在基因测序的酶学工具基础，也成为哈佛大学历史上收益最多的专利之一。

朱斌回忆说：“测序酶带来的专利收益不仅给予了我巨大的研究自由，使我得以开始尝试一些看似“冷门”的课题（比如海洋微生物中未知功能蛋白质的解析），更是极大的影响了我对独立研究方向的选择。它让我切身体会到，非常基础的微生物核酸代谢研究同样能给生命医学和生物技术乃至人们的生活带来很大的影响。”

纵观分子生物学的发展史，大多数革命性进展的基础都是来源于微生物的核酸工具酶，包括限制性内切酶和连接酶带来分子克隆技术，Taq DNA聚合酶让PCR成为可能，测序酶推进DNA测序，Cas9带来基因组编辑革命等等。朱斌认为，这些里程碑式发展可以推断，新颖的微生物核酸代谢酶将来还会带来生物学新的革命。

他强调，近年来测序技术和宏基因组学的发展正揭示着一个前所未见的巨大微生物世界。一些分子生物学尚未广泛触及的环境（例如海洋中的微生物）蕴藏着地球上最大的新型基因和蛋白质宝库，当下正是发现新奇蛋白质的绝佳时机。而他一直以来都对海洋和极端环境的生物有着强烈的兴趣。

“每次潜水为海洋生物的多样和奇特赞叹时，也会推断它们在分子水平上一定也有着同样的多样性和新颖性。所以，选择核酸代谢酶这一研究方向既是资源和需求的结合，也是兴趣和专长的统一。”朱斌总结道。

5、他希望：“玩出”中国原创的核酸工具酶和核酸生物技术

科学研究曾被称为“坐冷板凳”。朱斌也曾经历过近9年的漫长博士后阶段，但是他对科研的看法却很特别，他认为“科研是一种规则比较复杂并且硬件要求比较高的玩法”，一旦掌握规则并且有了条件之后就会乐趣无穷。

他在采访最后说：“非常幸运一路走来得到了两位导师的‘容忍’和支持，也承蒙青年千人计划的青睐和华中科技大学的接纳，使我能够有条件玩起来。我不喜欢也没有信心去挑战热门课题，而是喜欢独辟蹊径地研究一些别人不太关注的东西，希望能玩出自己的特色。鉴定一个未知的蛋白质功能极大满足我的好奇心，我也坚信这些工作能为人们了解蛋白质世界添砖加瓦，实现我的社会价值。最大的希望是玩出中国原创的核酸工具酶和核酸生物技术，打破国外的绝对垄断。”

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